樣本來源
對于IHC，組織是來自患者或動物，經(jīng)過冷凍或石蠟包埋。然后切成約4μm厚的切片。對于ICC，大部分細胞外基質(zhì)被去除，只剩下整個細胞來染色，來源可以是細胞懸液，或組織培養(yǎng)細胞系。
然而IHC遠遠不止于把抗體放在組織切片上、然后用顯微鏡觀察那么簡單。要想得到實用、可靠而清晰的結(jié)果，就需要耐心的對每一步進行優(yōu)化。根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法和免疫酶法，R&DSystems的網(wǎng)站列出了IHC/ICC實驗設(shè)計和優(yōu)化的變量及影響因素如下：
樣本類型：組織或細胞
樣本制備：組織（石蠟或冰凍），細胞：（貼壁細胞或細胞懸液）
適當(dāng)對照：無一抗，組織類型。
固定方法：灌注或浸泡。
固定劑：甲醛，醇類，丙酮。
封閉液：正常血清，牛血清蛋白（BSA）或脫脂奶粉。
抗原修復(fù)：蛋白酶，加熱。
檢測方法：直接或間接
一抗：物種
二抗：物種
標(biāo)記物：熒光或酶（顯色）
復(fù)染劑：蘇木精或DAPI（熒光）
封片劑：抗淬滅或水性
顯微鏡觀察：熒顯微鏡或光學(xué)顯微鏡
處理不同樣本的區(qū)別
ICC需要透化，要么通過固定過程，要么是單獨的透化步驟，而IHC可能不需要單獨的透化步驟，這取決于切片的厚度和固定方法。包埋在石蠟中的組織樣本在抗體染色前需要進一步處理。一旦處理好樣品，IHC和ICC的染色操作就幾乎沒什么差異了。
樣本固定和制備
組織石蠟包埋前的組織固定：4%甲醛固定劑是組織灌注和浸潤固定的常用溶液，一般需要4–24h，能很好地保留組織形態(tài)，切片機切片，貼附于載玻片干燥，石蠟切片存儲室溫多年，后續(xù)進行IHC/ICC之前需要再水化，需要抗原修復(fù)。
培養(yǎng)細胞固定：2%甲醛室溫固定20min，細胞樣本貼附載玻片，對于貼壁細胞直接放在6孔或24孔底部的無菌載玻片上生長，懸浮細胞可通過與包被多聚賴氨酸的載玻片孵育10min而附著在載玻片上。
冰凍組織切片固定：切片后用醇類固定，用于檢測磷酸化依賴的表位，在低溫箱進行樣本切片，冰凍切片存儲–80℃多達一年。通常保留酶的活性和抗原功能，不需要抗原修復(fù)，冰晶的形成可能負面影響組織結(jié)構(gòu)。
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